簡述NEST細(xì)胞培養(yǎng)以單管凍存細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方案

　　NEST細(xì)胞培養(yǎng)是從事微生物學(xué)及生命科學(xué)研究的基本材料，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，診斷制品的制備，菌苗的生產(chǎn)、微生物致病性研究，藥物的抑菌試驗(yàn)及藥品微生物檢驗(yàn)等都有一套完整的菌種菌種分為母種(一級(jí)種)、原種(二級(jí)種)和栽培種(三級(jí)種)三級(jí)。
 

　　NEST細(xì)胞培養(yǎng)的凍存:為避免污染造成的損失，至小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。
 

　　NEST細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等)，使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。培養(yǎng)物是單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群。細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)都要生活在人工環(huán)境中，由于環(huán)境的改變，細(xì)胞的移動(dòng)或受一些其他因素的影響，培養(yǎng)時(shí)間加長，傳代導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)單一化型。
 

　　NEST細(xì)胞培養(yǎng)下列步驟以單管凍存細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)方案為例。
 

　　1、準(zhǔn)備一燒杯37°C的水。
 

　　2、從液氮儲(chǔ)存中取出一管細(xì)胞，注意保護(hù)手和眼睛。
 

　　3、擰松管蓋1/4圈，等待10秒鐘以釋放螺紋中可能殘留的液氮，再重新擰緊管蓋。
 

　　4、將凍存管的下半部分置于37°C水浴中進(jìn)行解凍，直至凍存管內(nèi)僅剩余一小塊冰芯，使細(xì)胞迅速解凍。
 

　　5、用消毒液擦拭管體外表面，再將其移至II級(jí)A型層流細(xì)胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥中。
 

　　6、打開管蓋，使用1mL移液器上下吹打細(xì)胞懸液以分散細(xì)胞。
 

　　7、從管中吸取20uL細(xì)胞懸液，并將其稀釋于20uL臺(tái)盼藍(lán)溶液中。
 

　　8、使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板來確定每毫升懸液中的活細(xì)胞數(shù)。
 

　　9、將管中懸液(1mL)稀釋至產(chǎn)品說明中的推薦濃度。
 

　　10、將5mL細(xì)胞懸液加入25cm2培養(yǎng)瓶，或?qū)?5mL細(xì)胞懸浮液加入75cm2培養(yǎng)瓶中。
 

　　11、搖勻培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基以*分散細(xì)胞。許多類型的細(xì)胞都會(huì)迅速貼壁，如果沒有在傳代后即刻搖勻細(xì)胞，細(xì)胞可能生長不均勻。
 

　　12、在37°C、5%CO2/95%空氣、濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。為了獲得*結(jié)果，培養(yǎng)開始后至少在24小時(shí)之內(nèi)不要擾動(dòng)細(xì)胞。